Los experimentos de Villemin confirmando la contagiosidad de la enfermedad obligaron a la comunidad médica a plantearse el hecho de que la tuberculosis era una infección específica y que su agente etiológico era transmisible, lo que abrió la veda para su captura. En 1882 un médico prusiano, Robert Koch, empleó un novedoso método de tinción y lo aplicó a muestras de esputo procedentes de pacientes con tuberculosis, revelándose por primera vez el agente causante de la enfermedad: el Mycobacterium tuberculosis, o bacilo de Koch, en su honor.
Cuando inició su investigación Koch conoció los trabajos de Villemin y de otros continuadores de su experimento como Julius Cohnheim o Carl Salomosen. También tenía a su disposición las muestras del "Pabellón de Tísicos" del Hospital de la Charité de Berlín. Antes de enfrentarse al problema de la tuberculosis había trabajado con una enfermedad del ganado que en ocasiones se transmitía al hombre denominada carbunco, y de la que también descubriría el agente causal: el "Bacillus anthracis". De esta investigación saldría su fructífera amistad y colaboración permanente con Ferdinand Cohn, director del Instituto de Fisiología Vegetal. Comienza a desarrollar métodos de cultivo de muestras de tejidos, lo que le pone en el camino del descubrimiento que comenzaría con una observación en su laboratorio el 18 de Agosto de 1881. Durante una tinción de material con azul de metileno descubrío unas estructuras de forma alargada, que no podía ver si no aplicaba ese colorante. Para mejorar el contraste decidió añadir marrón de Bismarck, descubriendo que las estructuras se volvían así brillantes y transparentes. Y aún mejoró la técnica empleando álcalis, hasta determinar su concentración idónea para la visualización de los bastones. Había dado con la combinación que permitía teñir la peculiar cubierta del bacilo tuberculoso: una mezcla de fucsina y anilina, cuyas propiedades básicas permitían visualizar al microorganismo.
Tras varios intentos fue capaz de incubarlo en suero sanguíneo coagulado, otra novedad, ya que la gelatina usada habitualmente para cultivos en esa época se licuaba a los 37 grados centígrados necesarios para su crecimiento. La prueba definitiva la obtuvo inoculando cultivos puros de lo que él mismo ya denominaba "bacilo tuberculoso" en conejos, y observando que todos ellos murieron con los mismas síntomas de la tuberculosis. Y de sus cadáveres podía obtener, de nuevo, cultivos del bacilo.
Finalmente hace públicos su resultados en la Sociedad Fisiológica de Berlín, el 24 de marzo de 1882, en una ponencia que titula Über Tuberculose. Desde entonces en esa fecha se celebra cada año el Día Mundial de la Tuberculosis.
Este proceso lo repite con otros microorganismos lo que le lleva a enunciar los postulados que también llevan su nombre, sobre enfermedades transmisibles: El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad en las condiciones apropiadas y ausente en las personas sanas. El agente no debe aparecer en otra enfermedad de manera fortuita o saprófita. El agente debe ser aislado del cuerpo en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad. El agente debe provocar la enfermedad en un animal susceptible al ser inoculado. El agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en los animales de experimentación.
El 10 de abril de 1882 presenta un artículo titulado Die Ätiologie der Milzbrandkrankheit (De la etiología de la Tuberculosis) en el que demuestra de manera exhaustiva que el Mycobacterium es el causante único de la TB en todas sus variantes. La trascendencia del descubrimiento es tal que The Times publica una carta de John Tyndall con un resumen del hallazgo y poco después (el 3 de mayo) se hacen eco el New York Times y el New York Tribune.
La comunidad científica se lanza a verificar los resultados: Theoblad Smith y E. L. Trudeau en Estados Unidos o Paul Ehrlich, Franz Ziehl y Friedrich Neelsen en Alemania, estos últimos mejorando además el método de tinción que a partir de entonces se conocerá como Tinción de Ziehl Neelsen. En 1908 el mismo Koch desarrolla la tuberculina en colaboración con el veterinario Camille Guérin un derivado proteico purificado estándar del bacilo, también denominado PPD, que creía útil como agente inmunizante pero que Charles Mantoux depuraría posteriormente para administrar por vía intradérmica como método diagnóstico ya que su aplicación intadérmica, habitualmente del antebrazo, genera una respuesta inmunitaria diferente en el huésped si este ha estado en contacto previo con el bacilo tuberculoso que si no lo ha hecho.
